In der sich rasch entwickelnden Welt der Biotechnologie stellt die Entwicklung von Proteinen mit verbesserter Stabilität eine entscheidende Herausforderung dar. Ob bei der Entwicklung industrieller Biokatalysatoren oder bei der Konzeption wirksamerer pharmazeutischer Biologika - Proteine, die der Entfaltung und Aggregation widerstehen können, sind unerlässlich. Computergestützte Methoden, die genau vorhersagen können, wie sich Aminosäuremutationen auf die thermodynamische Stabilität eines Proteins auswirken, könnten den Prozess der Proteinentwicklung revolutionieren. Bislang haben sich die vorhandenen Berechnungswerkzeuge jedoch schwer getan, stabilisierende Mutationen zuverlässig zu identifizieren.

Hier kommt Stability Oracle ins Spiel, ein neues Deep-Learning-System, das modernste Methoden bei der Vorhersage von thermodynamisch stabilisierenden Proteinmutationen übertrifft. Stability Oracle wurde von einem Forscherteam an der University of Texas in Austin entwickelt und stellt einen großen Fortschritt in unserer Fähigkeit dar, Proteine mit verbesserter Stabilität rechnerisch zu entwickeln.

Die Notwendigkeit einer verbesserten Stabilitätsvorhersage

Proteine sind die Arbeitspferde der Biologie, die in lebenden Organismen eine Vielzahl von wichtigen Funktionen erfüllen. Ihre Fähigkeit, sich zu komplexen dreidimensionalen Strukturen zu falten und diese Strukturen beizubehalten, ist für ihre Funktion unerlässlich. Proteine, die zur Entfaltung oder Aggregation neigen, sind oft weniger effektiv oder sogar völlig funktionsunfähig.

Dies ist eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Biotechnologien auf Proteinbasis. Industrielle Enzyme, die in Produktionsprozessen eingesetzt werden, müssen beispielsweise rauen Bedingungen wie hohen Temperaturen oder dem Vorhandensein von organischen Lösungsmitteln standhalten können. Pharmazeutische Proteinmedikamente müssen ebenfalls ihre strukturelle Integrität während der Produktion, Lagerung und Verabreichung beibehalten. Die Verbesserung der thermodynamischen Stabilität dieser Proteine ist eine der wichtigsten Prioritäten.

Traditionell war dies ein mühsamer Versuch-und-Irrtum-Prozess. Die Forscher nahmen iterativ Mutationen an der Sequenz eines Proteins vor, testeten experimentell die Auswirkungen auf die Stabilität und arbeiteten schrittweise auf eine stabilere Variante hin. Dieser Ansatz ist jedoch zeit- und ressourcenaufwändig. Computergestützte Methoden, die die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstabilität genau vorhersagen können, könnten diesen Prozess erheblich beschleunigen.

In den letzten 15 Jahren wurde eine Vielzahl von computergestützten Stabilitätsvorhersageinstrumenten entwickelt, die sowohl auf physikalischen Grundlagen als auch auf maschinellem Lernen basieren. Diese Methoden hatten jedoch mit mehreren zentralen Problemen zu kämpfen, die verhinderten, dass sie einen transformativen Einfluss auf das Protein-Engineering hatten.

"Der Mangel an Daten und technische Probleme beim maschinellen Lernen haben verhindert, dass Deep-Learning-Algorithmen einen ähnlich revolutionären Einfluss auf die Vorhersage der Proteinstabilität hatten wie in anderen Bereichen der Biologie und Chemie", erklärt Daniel Diaz, einer der Hauptautoren der Studie Stability Oracle.

Zu den wichtigsten Herausforderungen gehören Datenknappheit, Verzerrungen und Lecks sowie die Verwendung ungeeigneter Leistungskennzahlen. Die aktuellen Datensätze sind stark auf destabilisierende Mutationen ausgerichtet, wobei stabilisierende Mutationen nur 30 % oder weniger der Daten ausmachen. Außerdem gibt es erhebliche Überschneidungen zwischen Trainings- und Testdatensätzen, was zu übermäßig optimistischen Leistungsbewertungen führt, die die reale Generalisierung nicht widerspiegeln.

Am wichtigsten ist vielleicht, dass sich das Feld zu sehr auf Metriken wie die Pearson-Korrelation und den mittleren quadratischen Fehler (Root Mean Squared Error, RMSE) konzentriert hat, die die Fähigkeit eines Modells, stabilisierende Mutationen zu identifizieren - das Hauptziel für Protein-Engineering-Anwendungen - nicht angemessen erfassen.

"Verbesserungen dieser Metriken führen nicht unbedingt zu Verbesserungen bei der Identifizierung stabilisierender Mutationen", stellt Diaz fest. "Metriken wie Präzision, Recall und Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Kurve sind für die Bewertung des praktischen Nutzens dieser Modelle viel relevanter."

Einführung von Stability Oracle

Um diese langjährigen Herausforderungen zu bewältigen, verfolgte das Stability Oracle-Team einen mehrgleisigen Ansatz, indem es neue Techniken zur Datenkuratierung, innovative Deep-Learning-Architekturen und geeignetere Methoden zur Leistungsbewertung entwickelte.

Die Grundlage von Stability Oracle ist ein neuronales Netz mit Graph-Transformator, das lernt, strukturelle Merkmale aus der lokalen chemischen Umgebung eines Zielaminosäurerests zu extrahieren. Diese "maskierte Mikroumgebung" wird dann mit Einbettungen kombiniert, die die Wildtyp- und die mutierten Aminosäuren darstellen, um die Änderung der thermodynamischen Stabilität (ΔΔG) vorherzusagen, die sich aus dieser Mutation ergibt.

"Anstatt sich auf rechnerisch erzeugte Mutantenstrukturen zu verlassen, die teuer und fehleranfällig sein können, lernt Stability Oracle, implizit zu modellieren, wie die 'von' und 'zu' Aminosäuren mit der lokalen Chemie interagieren", erklärt Chengyue Gong, ein weiterer Hauptautor.

Durch diese Designwahl kann Stability Oracle effizient Vorhersagen für alle 380 möglichen Einzelpunktmutationen ausgehend von einer einzigen Proteinstruktur erstellen - eine enorme Verbesserung der Berechnungseffizienz gegenüber früheren strukturbasierten Methoden.

Um die Datenherausforderungen zu bewältigen, stellten die Forscher mehrere neue Trainings- und Testdatensätze zusammen. Sie verwendeten Sequenzcluster, um eine minimale Überlappung zwischen den Proteinen in den Trainings- und Testdatensätzen zu gewährleisten - ein entscheidender Schritt, um die Generalisierung richtig zu bewerten.

Sie führten auch eine neue Technik zur Datenerweiterung ein, die "thermodynamische Permutationen" (TP). TP nutzt die Zustandsfunktionseigenschaft der freien Gibbs-Energie, um einen relativ kleinen Satz experimenteller ΔΔG-Messungen zu einem viel größeren, thermodynamisch gültigen Datensatz zu erweitern. Wichtig ist, dass TP eine ausgewogene Verteilung von stabilisierenden und destabilisierenden Mutationen erzeugt, im Gegensatz zu den stark verzerrten Datensätzen, die in früheren Arbeiten verwendet wurden.

"TP ermöglicht es uns, die Fähigkeit eines Modells, stabilisierende Mutationen zu identifizieren, besser einzuschätzen, was das Hauptziel für Protein-Engineering-Anwendungen ist", so Diaz.

Zusätzlich zu den TP-augmentierten Datensätzen hat das Team das Stability Oracle-Framework an einem massiven Datensatz von über 2 Millionen Proteinstabilitätsmessungen, die aus einem Hochdurchsatz-Proteolyse-Assay an natürlichen und de novo Mini-Protein-Domänen stammen, feinabgestimmt.

Mehr Leistung als der Stand der Technik

With these innovations in data curation and model architecture, Stability Oracle demonstrates a remarkable ability to predict thermodynamically stabilizing protein mutations. On a rigorously curated test set, Stability Oracle achieved a precision of 0.70 and a recall of 0.69 in identifying stabilizing mutations (defined as ΔΔG < -0.5 kcal/mol).

Diese Leistung übertrifft die Leistung bestehender hochmoderner Berechnungswerkzeuge, die in der Regel nur etwa 20 % Erfolg bei der Identifizierung stabilisierender Mutationen haben. Die Genauigkeit von Stability Oracle bei dieser Aufgabe liegt auf dem Niveau von FEP-Methoden (Free Energy Perturbation), die als Goldstandard für die rechnerische Stabilitätsvorhersage gelten, aber für groß angelegte Protein-Engineering-Anwendungen unerschwinglich teuer sind.

"Die Fähigkeit von Stability Oracle, die Leistung von FEP-Methoden zu erreichen und dabei um mehrere Größenordnungen schneller zu sein, ist ein großer Durchbruch", sagt Adam Klivans, leitender Autor der Studie.

Das Team entwickelte auch ein sequenzbasiertes Gegenstück zu Stability Oracle, genannt Prostata-IFML, durch Feinabstimmung des leistungsstarken Proteinsprachmodells ESM-2. Während Prostata-IFML ebenfalls eine beeindruckende Leistung zeigte, übertraf der strukturbasierte Ansatz von Stability Oracle das reine Sequenzmodell in einer Reihe von Messgrößen.

"Die Tatsache, dass Stability Oracle mit weit weniger Parametern als Prostata-IFML ein modernes Sequenzmodell übertreffen kann, unterstreicht den Wert der Einbeziehung von Strukturinformationen", erklärt Gong. "Proteinstrukturen enthalten wichtige Informationen, die über die Aminosäuresequenz hinausgehen."

Das Strukturbewusstsein von Stability Oracle wird auch durch seine Fähigkeit belegt, stabilisierende Mutationen in verschiedenen Regionen eines Proteins genau vorherzusagen. Die Analyse der Vorhersagen des Modells zeigte keine Verzerrung bei der Identifizierung stabilisierender Mutationen an der Proteinoberfläche gegenüber dem Kern, eine häufige Einschränkung früherer strukturbasierter Methoden.

"Stability Oracle ist in der Lage, Mutationen sowohl in lösungsmittelexponierten als auch in vergrabenen Regionen des Proteins zu erfassen", so Diaz. "Dies ist eine wichtige Fähigkeit für die Entwicklung von Proteinen mit verbesserter Stabilität.

Beschleunigung des Protein-Engineerings

Die Auswirkungen der Leistung von Stability Oracle gehen weit über ein akademisches Benchmarking hinaus. Dieses Werkzeug hat das Potenzial, die Entwicklung einer breiten Palette von proteinbasierten Biotechnologien drastisch zu beschleunigen.

"Die genaue Identifizierung von stabilisierenden Mutationen wird sich auf alle Bereiche auswirken, von der Vorhersage von Proteintherapeutika mit längerer Haltbarkeit bis hin zur Entwicklung von Enzymen, die rauen industriellen Bedingungen standhalten können", sagt Andrew Ellington, Mitautor und Experte für Protein-Engineering.

Bei der Entwicklung von Medikamenten auf Proteinbasis beispielsweise könnte die Fähigkeit, Millionen potenzieller Mutationen rechnerisch zu screenen und die stabilsten zu identifizieren, den Zeit- und Kostenaufwand für die experimentelle Optimierung erheblich reduzieren. In der industriellen Biokatalyse könnte das Stabilitätsorakel die Entwicklung von Enzymen leiten, die widerstandsfähiger gegen Denaturierung sind, und so die Bandbreite der Prozesse erweitern, für die sie eingesetzt werden können.

Neben der Vorhersage der Auswirkungen von Einzelpunktmutationen arbeitet das Team von Stability Oracle bereits an der Erweiterung des Rahmens, um Mutationen höherer Ordnung zu behandeln. "Datenknappheit ist eine noch größere Herausforderung für die Vorhersage der Auswirkungen mehrerer gleichzeitiger Mutationen", erklärt Diaz. "Aber die Innovationen, die wir mit Stability Oracle entwickelt haben, wie thermodynamische Permutationen, bieten einen Fahrplan für die Bewältigung dieses Problems."

Die Forscher sehen das Stabilitätsorakel auch als Sprungbrett für ein breiter angelegtes Ziel, nämlich die Verwendung von Deep Learning für das De-novo-Design von hochstabilen Proteingerüsten. "Wenn wir genau modellieren können, wie sich Mutationen auf die Stabilität auswirken, besteht die nächste Grenze darin, dieses Wissen zu nutzen, um völlig neue Proteinstrukturen von Grund auf zu entwerfen", sagt Klivans.

Ein Weg in die Zukunft für Protein Engineering

Die Entwicklung von Stability Oracle stellt einen bedeutenden Meilenstein in dem Bestreben dar, die Möglichkeiten des Deep Learning für das Protein-Engineering nutzbar zu machen. Durch die Bewältigung langjähriger Herausforderungen in den Bereichen Datenqualität, Modellarchitektur und Leistungsbewertung zeigt dieses Framework das Potenzial für ein KI-gesteuertes Proteindesign, das eine breite Palette von Biotechnologien verändern kann.

"Stability Oracle setzt neue Maßstäbe für die computergestützte Stabilitätsvorhersage und bietet einen klaren Weg für die Feinabstimmung strukturbasierter Transformatoren auf praktisch jeden Proteinphänotyp", so Diaz abschließend. "Dies ist eine notwendige Aufgabe, um die Entwicklung proteinbasierter Biotechnologien in den kommenden Jahren zu beschleunigen."

Im Zuge der weiteren Entwicklung des Protein-Engineerings werden Werkzeuge wie Stability Oracle zweifellos eine immer zentralere Rolle spielen. Diese Technologie ermöglicht es Forschern, stabilere und wirksamere Produkte auf Proteinbasis zu entwickeln, und könnte weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Branchen haben - von der Pharmaindustrie bis hin zu sauberer Energie. Die Zukunft der Biotechnologie sieht stabiler aus als je zuvor.

Hinweis(e)

1. https://doi.org/10.1038/s41467-024-49780-2

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